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探索空间精巧-空间转录组经由详解

发布日期:2022-06-18 16:45    点击次数:128

探索空间精巧-空间转录组经由详解

为了剖释发育和疾病发祈望制,洽商人员需要揭示复杂的多细胞组织的结构。组织学和免疫荧光期间可显现组织样式学和生物标志物。空间 RNA 测序(RNA-seq)行使新一代测序(NGS) 的力量,以空间分辩率分析基因抒发1。

空间转录组学执行将分子和样式学特征相伙同,不错提供已往无法取得的组织生物学信息。组织界限内的全转录组分析不错终局确实的探索性科学洽商,并有助于揭示健康和疾病景色下细胞之间的空间关连2-7。

今天,为天下先容的是一种从组织切片绘图圆善转录组,同期保留样式学布景的决策:

使用10x Genomics的Visium空间基因抒发,对所有这个词组织切片进行转录分析。

使用NovaSeq6000、NextSeq 2000、NextSeq 1000 或 NextSeq 550系统对空间RNA-Seq文库进行测序。

可视化掩饰基因活性的组织样式,以了解平时组织和病变组织细胞之间的空间关连。

执行决策笼统

典型的空间RNA-Seq执行奉命一个由组织样本制备、成像、 文库制备、测序和分析构成的责任经由(图1)。本执行决策使用10x Genomics的Visium空间基因抒发和熟识的Illumina测序期间。再行鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织运转,制成切片并置于Visium玻片上。对组织切片进行染色,使用 Visium试剂生成添加条形码、空间感知的全转录组文库。在Illumina分娩限制的测序系统上对文库进行测序, 如 NovaSeq 6000、NextSeq 2000、NextSeq 100或NextSeq 550系统。使用 Space Ranger 经由(10x Genomics)进行数据分析,借助来自 Visium 玻片的空间条形码,将转录组基因抒发后果与组织位置有关联。Loupe Browser软件(10x Genomics) 不错纵容地在组织图像的样式学数据之上可视化和探索空间基因抒发数据。

图1:空间 RNA-Seq 执行的责任经由

1)制备组织切片

把柄您的样本类型(清新冷冻或 FFPE)遴荐符合的 Visium 空间基因抒发执行决策。可在10x Genomics 复古中心网站上取得Visium 样本制备的演示决策8-9。

2)对组织切片进行染色和成像

使用模范期间对抛弃在 Visium 玻片上的组织切片进行苏木精-伊红(H&E)或免疫荧光染色。使用显微镜对染色组织切片进行成像。顺利的基因抒发可视化高度依赖于雅致的染色和成像扩充10。

3)透化组织并构建文库

对组织切片成像后,可使用Visium空间基因抒发试剂盒拿获清新冷冻或 FFPE组织的转录本。Visium 空间基因抒发玻片有四个正方形区域或拿获区域,每个玻片最多可运行四个组织切片*。每个拿获区域罕有千个条形码位点,包含数百万个拿获寡核苷酸,每个位点都有独一的空间条形码(图2)。

* 在文库制备期间,每个拿获区域还会取得一个样本条形码,以便在一次测序运行中,不错搀和来自不同拿获区域的多个文库。其他Visium玻片的每张玻片有两个或八个拿获区域。

图2:Visium 空间基因抒发玻片诡计

4)使用Illumina仪器测序

依照空间组学的测序需求,冷落在 NovaSeq 6000、NextSeq 2000、NextSeq 1000或NextSeq 550系统上对Visium空间基因抒发文库进行测序(表1)。小限制仪器,如iSeq 100系统可用于文库质料戒指11。

表1:Illumina 测序系统上 Visium 空间基因抒发分析的样本通量示例

Visium空间基因抒发文库包含模范的Illumina双端构建体, 51午夜精品免费视频 两侧为i5和i7标签,这些标签是Illumina 流动槽伙同所必需的(表2,图3)。Read 1引物用于测序16 bp的空间条形码和长达12 bp的独一分子秀丽(UMI)。Read 2引物用于测序cDNA,或聚积探针、插入片断。两个10 bp样本标签在i5和i7 read中进行测序12。

Visium文库的冷落测序深度取决于几个身分,包括组织复杂性、组织掩饰度和执行标的。空间基因抒发文库需要通过双端测序运行进行测序。(更多详备信息,请下载全文)

表2:Visium空间基因抒发文库的冷落read 树立

图3:Visium 空间基因抒发文库树立— Visium空间基因抒发文库包括与 Illumina 测序系统兼容的模范双端构建体。

5)数据的分析和可视化

在 Visium责任经由中,拿获两种主要数据类型:组织图像和BCL或FASTQ步履的测序数据。Space Ranger分析经由使用这两种数据输入将Visium测序数据与图像比对。把柄有关的空间条形码,将拿获的检测到的每个基因转录天职派至组织图像上的空间位置。数据经管后,您不错使用Loupe Browser可视化软件纵容查询空间基因抒发数据的不同视图。Loupe Browser允许您洽商病笃的基因、表征和分析簇,并进行各异抒发分析。或者,您不错使用第三方用具进一步经管数据。

数据亮点

空间转录组学分析好像在清新冷冻组织(图4)13或 FFPE样本 (图5)的组织环境中对基因抒发进行高分辩率表征14。

图4:清新冷冻小鼠大脑数据亮点—(A)小鼠大脑冠状切片的 H&E 染色图像。(B)掩饰一起UMI的Visium 数据,好吊妞用于基于总各异抒发基因的全转录 组分析或空间自然位点聚类分析。(C)簇 4 中抒发水平最高的基因列表13。

图 5:乳腺导管原位癌的 FFPE 乳腺组织数据亮点 — 使用适用 FFPE 的 Visium 空间基因抒发,对乳腺导管原位癌 FFPE 样本中约 1.8 万个基因进行了检测。(A)H&E 染色图像与 Visium 的数据重叠,用于 FFPE 全转录组分析,此处显现为(B)基因总和和(C)位点聚类分析。(D)要道乳腺癌基因的抒发水 和蔼空间结构如下所示:ERBB2(HER2)、孕酮受体(PGR) 和雌激素受体(ESR1)14。

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NovaSeq 6000系统

NextSeq 1000和NextSeq 2000系统

NextSeq 550系统

Visium空间基因抒发

参考文件

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